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            獨家專訪中國學者《Cell》首發跨組織單細胞水平的肝癌免疫圖譜

            圖1:參與研究人員合影,來源/張澤民課題組

            北京時間11月1日,國際知名學術期刊《Cell》發布我國單細胞研究代表學者張澤民教授課題組的最新癌癥研究成果:Landscape and Dynamics of Single Immune Cells in Hepatocellular Carcinoma。這是繼2017年在《Cell》上發布肝癌微T細胞圖譜,2018年在《Nature》、《Nature Medicine》上分別發布結直腸癌、肺癌單細胞圖譜后,張澤民課題組首次發布跨組織單細胞水平的肝癌免疫圖譜。論文作者第一時間接受了基因慧獨家專訪。


            一、產學研醫合作:北大、世紀壇醫院、藥企勃林格殷格翰
            1)產學研醫機構合作的共同研究成果,包括北京大學生物醫學前沿創新中心(BIOPIC)、生命科學學院、北京未來基因診斷高精尖創新中心(ICG)和首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院、德國藥企勃林格殷格翰公司。?
            2)北京大學BIOPIC和生命科學學院博士生張啟明、北京大學前沿交叉學院博士生何堯和北京世紀壇醫院博士生羅楠為該論文的并列第一作者,北京大學BIOPIC和生命科學學院任仙文副研究員、張澤民教授、勃林格殷格翰公司主任科學家劉康博士和北京世紀壇醫院彭吉潤教授為該論文的共同通訊作者。
            3)肝癌單細胞數據已上傳至交互式網站,可通以下網址查看:
            http://cancer-pku.cn:3838/HCC/

            二、首次發布肝癌跨組織單細胞免疫圖譜
            圖2:本課題研究思路,來源/《Cell》

            1)基于兩種單細胞測序數據,本研究繪制了高分辨率的肝癌免疫圖譜,包括T細胞、B細胞、NK細胞和髓系細胞等主要細胞類群以及主要類群下屬的40類細胞亞群。腹水中的細胞類型表型出明顯的特異性,其中髓系細胞主要來源于腫瘤中的巨噬細胞。2)通過轉錄組測序,發現肝癌的巨噬細胞呈現兩種狀態:TAM-like和MDSC-like狀態,前者表達的兩個關鍵基因SLC40A1和GPNMB與預后不良有關,在細胞炎癥反應中起重要作用。3)在體外實驗證實了LAMP3+ DC是成熟態的樹突狀細胞(也稱DC細胞), 且具有向肝淋巴結遷移和與多種淋巴細胞相互作用的潛在能力。

            【基因慧】祝賀時隔一年在單細胞癌癥免疫攻關上取得的突破進展!相對于2017年在《Cell》上發布的肝癌微T細胞圖譜,2018年在《Nature》、《Nature Medicine》上發布結直腸癌和肺癌單細胞圖譜,這次課題有什么重大發現呢?可以通俗地、概括性地分享一下嗎?

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            【張澤民教授】本項目仍然選擇了肝癌作為研究對象,因為肝細胞癌是世界范圍內死亡率排名第三的癌癥,其中中國的肝癌發病率居世界之首。HBV的慢性感染是中國肝細胞癌發生的主要原因,其感染導致腫瘤微環境常伴隨慢性炎癥。免疫逃逸被認為是癌癥發展的標志之一,目前研究表明,腫瘤存在多種免疫逃逸機制,突出了研究腫瘤微環境中不同免疫細胞狀態的重要性。
            相比我們實驗室之前在不同癌種中進行的T細胞的研究,本項目同時關注了T細胞之外的其他免疫細胞,并探究了免疫細胞在不同組織之間的聯系以及不同類型免疫細胞之間的潛在相互作用。比如,腹水是肝癌患者常見的病理現象,其產生與肝癌預后不良有關,然而腹水中的免疫細胞組成及其與肝癌的聯系尚不清楚。
            我們通過前沿的生物信息學分析方法,建立了腹水中免疫細胞與其他組織中細胞的聯系,主要發現腹水中的淋巴細胞和髓系細胞來源明顯不同,淋巴細胞與外周血來源的細胞有明顯的相似性,而髓系細胞主要和腫瘤組織來源的細胞類似。同時,樹突狀細胞(DC)在腫瘤微環境中起到重要的調控作用。腫瘤微環境中的DC,傳統上分為cDC1和cDC2,而我們基于測序數據鑒定出一群特點突出的LAMP3+ DC。它們可從腫瘤遷移到外周淋巴結,表達多種免疫配體基因,并具有與多種T淋巴細胞類型相互作用的潛力。

            三、創新的課題設計思路
            1)在樣本收集上,除了常規的癌組織、癌旁組織、淋巴結、外周血,收集了病理組織在內的多組織位點的收集。?
            2)結合兩種單細胞測序技術平臺:SMART-seq2和10x Genomics Chromium 3’,并整合兩種轉錄組測序數據進行生物信息分析。?
            3)基于前沿的生物信息學分析方法RNA velocity和基于線粒體突變構建進化樹。并通過CRISPR技術在THP-1誘導的巨噬細胞系中進行基因敲除和功能驗證實驗。
            ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 圖3:本課題總體設計,來源/《Cell》
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            【基因慧】課題總體設計的思路是怎樣的呢?

            【文章共同第一作者張啟明】本次課題設計在實驗和數據分析方面都有所突破。從測序平臺的選擇來說,我們兩種各具優勢的測序技術10x Genomics和SMART-seq2,前者基于微滴包被的原理,可實現一次實驗獲得較多的細胞數量,有效降低了單細胞測序的實驗成本;而后者測序技術則利用孔板對單個細胞進行實驗,通量相對較低,但每個細胞的基因捕獲率相對較高。我們通過整合這兩種平臺的數據進行生物信息學分析,充分發揮不同數據類型的優勢,獲得高分辨率的肝癌免疫圖譜。

            而就樣本收集而言,癌旁組織和外周血是腫瘤相關研究中常用的對照組織,而其他相關的免疫器官或病理組織則較少受到關注。就像張老師提到過的,腹水是肝癌患者常見的病理現象,其產生與肝癌預后不良有關,然而腹水中的免疫細胞組成及其與肝癌的聯系尚不清楚。因此,本研究收集肝癌病人的癌組織、癌旁組織、淋巴結、外周血和腹水五種組織的CD45+免疫細胞進行實驗,并分析肝癌免疫微環境中的細胞類型、表達特征,以及不同組織之間細胞的動態變化與聯系。

            【文章共同第一作者何堯】在數據分析方面的設計思路是與實驗相配合的。我們利用多組織、多平臺這一特點,大膽嘗試多種前沿的生物信息學分析方法,旨在充分挖掘數據中潛在的生物學意義。我們將不同平臺數據相結合進行分析的方式充分發揮了不同類型數據的優勢,而針對多組織這一特點選擇的不同的路徑追蹤方法則利用了數據不同層面的信息,包括基因表達、可變剪接、線粒體突變等,來共同揭示組織之間的動態變化。我們的設計思路也可擴展到其他癌癥的相關研究中。

             


            【基因慧】繼續選擇肝癌這個癌種研究單細胞水平的免疫圖譜,在技術層面可以談談相關原因嗎?這對于后續診斷和治療有哪些具體的指導意義呢?

            【張澤民教授】中國是肝癌大國,攻克肝癌是我們這代人的使命。對肝癌的科學理解也需要階段性。之前,我們為了簡化科學問題,只關注了腫瘤中的T細胞特征,對肝癌免疫微環境缺少全面的刻畫和理解。我們本項工作首次對肝癌臨床樣本進行包括病理組織在內的多組織位點的收集,并利用前沿的生物信息學分析方法,通過自體對照,不僅描述了肝癌微環境的免疫組分和狀態,而且描繪了腫瘤浸潤免疫細胞跨組織的動態過程。

            這為后續開發新的臨床檢測與治療方案提供了新的思路。例如,研究揭示了腫瘤中的巨噬細胞構成腹水中髓系細胞的主要來源。由于外周血的免疫特征與腫瘤中具有較大差異,而組織活檢的取樣難度相對較大,該結果為利用肝癌病人的腹水代替外周血或活檢組織進行腫瘤免疫狀態檢測提供了新的思路。

            針對巨噬細胞中與較差預后相關的基因GPNMB和SLC40A1,研究者通過揭示其在巨噬細胞中的炎癥作用,為相關藥物開發提供了潛在靶點。而研究發現的LAMP3+樹突狀細胞,可從腫瘤遷移到外周淋巴結,表達多種免疫配體基因,并具有與多種T淋巴細胞類型相互作用的潛力。這為后續進一步對該細胞類型進行研究和應用提供了基礎,為通過調節免疫微環境進行腫瘤治療提出了新的可能性,并為基于樹突狀細胞的細胞療法提供了新的思路和依據。

            本研究工作從深度、廣度和技術路線都和兩年前我們發表的肝癌T細胞工作有很明顯的不同,但是又有著相輔相成的關系。

             


            【基因慧】我們知道,目前常用的單細胞測序技術包括SMART-seq2和10x Genomics Chromium 3’等。課題組選擇了整合這兩個平臺,可以和基因慧讀者分享下在兩個單細胞測序平臺整合中,怎么樣進行優勢互補呢?

            【文章共同第一作者何堯】之前我們側重使用SMART-seq2測序技術,雖然數據質量非常高,但是實驗成本很高。10x的高通量性以及較低的造價也讓我們開始探索如何有效利用這些新型的測序技術。通過對兩種類型的數據進行單獨分析和整合分析,我們發現整合兩種實驗平臺的數據能夠充分發揮不同測序技術的優勢,識別出僅在一種平臺捕獲的細胞類群,獲得分辨率更高的肝癌免疫圖譜。

            例如,LAMP3+ 樹突狀細胞、CD14+單核細胞和FCGR3A+單核細胞僅在SMART-seq2數據中被識別,而先天淋巴細胞僅被10x數據捕獲,數據整合后能夠有效避免某一平臺引起的細胞類型的偏差。同時,經過數據整合,10x數據中CD4+和CD8+ T細胞不易區分的現象也被SMART-seq2數據“補救”了,獲得了較高的分辨率。

            因此,我們認為,聯合使用具有不同優勢的單細胞轉錄組測序技術進行細胞異質性的研究或可成為相關研究的范式策略之一。

             


            【基因慧】在腫瘤研究中,癌旁組織和外周血是常用對照組織。課題組在這次研究中首次收集了包括病理組織肝腹水在內的多組織位點。出發點是什么呢?首次操作過程中遇到的困難和解決過程,可以分享下嗎?

            【文章共同第一作者張啟明】其實前面也提到過,由于越來越多的研究表明機體對抗腫瘤是一個全身性、系統性的生物學過程,而不僅限于腫瘤內部,因此,我們實驗室在進行相關研究時一直關注腫瘤組織之外的自體對照的免疫特征,及其與腫瘤組織的聯系。腹水是肝癌患者常見的病理現象,其產生與肝癌預后不良有關,然而腹水中的免疫細胞組成及其與肝癌的聯系尚不清楚。

            因此,我們進行多組織,包括病理組織在內的標本收集,希望對肝癌的機制有更深了解。就實驗而言,首次進行處理時出現過很多困難,需要進行實驗條件摸索,才能夠成功獲取其中的免疫細胞。解決過程就是不斷嘗試各種各樣的實驗條件,通過排除法找到最優條件。而數據分析方面,任老師和何堯花了很多心思和精力進行探索。

            【文章共同通訊作者任仙文博士(北京大學副研究員)】癌旁組織和外周血作為對照組織是必要的,但不能充分揭示肝細胞癌的病理和免疫學特征。本次研究我們除了設置癌旁對照、外周血對照外,我們增加了腹水和淋巴結組織。產生大量腹水是重癥肝細胞癌的一個重要臨床特征,往往和預后不好相關聯。腹水從哪里來,腹水里的免疫細胞從哪里來,和腫瘤有什么樣的關系,對腫瘤的診斷和治療有什么重要意義,這些都是未解決的生物醫學問題。

            我們應用單細胞測序技術分析腹水和腫瘤的關系,為解決這些問題提供了新的線索。我們發現腹水里的淋巴細胞和髓系細胞具有不同的來源,淋巴細胞的主要來源可能是外周血,而髓系細胞的主要來源是腫瘤。特別地,腫瘤中某類特殊的巨噬細胞傾向于從腫瘤遷移到腹水當中,這一結論我們從表達譜相似性、RNA降解速率分析、線粒體基因突變分析以及體外培養等角度進行了論證,為后續基于腹水的微創肝細胞癌免疫狀況診斷提供了線索。

            在本課題中我們另外增加的一個對照組織是淋巴結。雖然肝細胞癌不常發生淋巴結轉移,但是淋巴結在免疫系統中扮演著重要的角色。淋巴結在腫瘤免疫中特別是肝細胞癌的免疫中扮演什么角色還不夠清楚。此次淋巴結組織的增加使得我們發現了一群特殊的LAMP3+的樹突狀細胞。我們應用生物信息學分析、體外培養、刺激、遷移實驗、免疫組化等不同手段證明了這群細胞的潛在功能,這一群細胞及其功能的發現對于深入理解腫瘤免疫具有重要意義。

             


            四、保護遺傳資源基礎上,互補協作

            【基因慧】?繼上次合作一家藥企后,我們看到這次北京大學生物醫學前沿創新中心、生命科學學院、北京未來基因診斷高精尖創新中心和首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院、德國藥企勃林格殷格翰公司聯合參與課題,可否談談藥企在其中的角色,以及未來系列研究的轉化方向?

            【張澤民教授】這是我們首次與勃林格殷格翰公司進行合作,是一次非常成功的合作。在實驗和數據分析過程中,我們通過討論交流,共同探索課題方向。特別是到項目后期,需要對分析結果進行生物學驗證時,勃林格殷格翰公司的多位科學家和課題組都參與到其中,充分發揮他們的優勢,完成了重要的實驗驗證,加強了本課題在免疫領域及應用轉化方面的研究,從而升華了整個課題的意義。

            在合作過程中,我們為了遵循中國遺傳辦關于中國遺傳信息保護的新規定,避免了與國外合作方分享任何中國病人的臨床信息以及遺傳信息,而在科學思路和單個基因功能驗證方面與其達到了有效的合作。我認為我們在充分保護中國遺傳信息的基礎上,通過多方密切聯系,調動和整合各方資源,完成了本項研究工作。

            由于我自己加入北大之前也是長期在藥企工作,我深深地感到在藥企工作的科學家對最急需的科學轉化問題有著更直接的判斷和把握,能夠幫助我們抓到問題的重點。不過,我們選擇的課題都是由北大主導的,知識產權也在中方。因為我們得到的科學進展都是“前競爭”(pre-competitive),我們的發現可以受益于國內外所有相關的制藥企業。當然,我們的發現是相對基礎的,離靶點發現和制藥還有很遠的距離,希望我們的發現能夠對國內外相關藥企理解和探索腫瘤免疫藥物起到積極作用。

            【文章共同通訊作者劉康博士(勃林格殷格翰公司主任科學家)】張教授與我們的本次合作可謂是一次高質量合作的范例。特別是在后期實驗驗證期間,我們頻繁的進行討論交流,充分挖掘后續值得深入探究的方向,包括重要的細胞類型、潛在的調控因子等。多方交流不僅能讓我們較好地應對課題中出現的問題和困難,也為我們后續對新的調控因子進行追蹤和跟進提供了便利。我們與張教授也繼續進行合作,希望將來可以和大家分享成果。

             


            【基因慧】?除了以上的信息,您還有其他需要和基因慧的科研和工業讀者分享的嗎?

            【張澤民教授】相比于十年前,現在從基礎研究到藥物研發之間的轉化時間越來越短,甚至可以說是齊頭并進,因此把基礎研究和轉化研究緊密融合一直是我追求的科研模式。我認為本項目采取的產、學、研、醫的幾方面合作模式是雙贏和多贏的模式,我們會繼續這樣的模式,把我們的技術和經驗推廣到更多的課題研究當中。

            在此,我要再次感謝我們的合作方世紀壇醫院的彭吉潤課題組以及勃林格殷格翰公司的多位科學家。在項目初始階段,我們在患者選擇和臨床需求上有一些困惑,通過和彭吉潤研究組的同學通力合作,探索了整個項目的具體實施細節,包括病人入組條件、取樣要求、單細胞轉錄組擴增方法等,從而保證項目的高效推進和運行。

            項目后期勃林格殷格翰公司與我們一起進行的功能驗證實驗則進一步加強了本課題在免疫領域及應用轉化方面的研究,從而進一步升華了整個課題的意義,這些對于整個課題的最終完成都有重要意義。

            【彭吉潤教授(北京世紀壇醫院主任醫師)】我們作為臨床醫生,對于目前存在的臨床痛點可能有更精準的把握,通過與張教授的課題組積極溝通,取長補短,共同探索課題的發展方向,課題中的一些結果具有巨大的臨床應用潛力。

             


            拓展閱讀?】

            《Cell》:首發大規模肝癌單細胞水平免疫圖譜

            《Nature》子刊:最大規模肺癌T細胞單細胞免疫圖譜

            《Nature》:最全面深入結直腸癌T細胞動態變化圖譜

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